Question Answer
Jaka nazywa sie nieaktywna postac trypsyny? Trypsynogen
Gdzie wydzielana jest trypsyna? W trzustce.
Co aktywuje trypsynogen do trypsyny? Autoaktywacja lub enterokinaza dzialajaca w dwunastnicy.
Rozwin skrot: BPTI Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor, inaczej aprotynina
Gdzie wystepuje BPTI? W organach bydlecych: plucach, trzustce, slinianki przyuszne i inne tkanki, bogate w tkanki tuczne.
Do jakiej rodziny inhibitorow nalezy BPTI? Inhibitory proteaz serynowych typu Kunitza.
Czym charakteryzuja sie inhibitory proteaz serynowych typu Kunitza? Inhibitory te maja specjalna domene tzw. Kunitza (sekwencje aminokwasowa), odpowiedzialna za aktywnosc inhibitorowa. Inhibitory te sa wewnatrzkomorkowymi polipeptydami wystepujacymi w wielu tkankach.
Wlasciwosci BPTI Silnie zasadowy, odporny na ekstremalne warunki srodowiska (nie traci akt. w czasie krotkiego gotowania w rozcienczonych kwasach lub w czasie inkubacji w TCA). Stabilny w wysokim pH.
Kiedy dochodzi do inaktywacji BPTI? Tylko w pH powyzej pI (pI=10,5).
Jakie proteazy podlegaja inhibicji przez BPTI? Bydleca ?-trypsyna, bydleca ?-chymotrypsyna, ludzkie enzymy: ?-plazmina i kalikreina osoczowa.
Zastosowanie kliniczne BPTI Ostre zapalenie trzustki, zapalenie otrzewnej, krwotoki pooperacyjne (bo inhibitor ?-plazminy).
Etapy preparacji BPTI z pluc bydlecych Ekstrakcja inhibitora, wysalanie bialek siarczanem (VI) amonu, wytracanie bialek balastowych za pomoca TCA, chromatografia powinowactwa, HPLC w ukladzie odwroconych faz.
Zasada metody enzymatycznej Trypsyna hydrolizuje p-nitroanilid N-benzoilo-DL-argininy (BApNA) z wydzieleniem p-nitroaniliny o zabarwieniu zoltym i max. absorpcji przy 410nm.
Dlaczego w przygotowaniu krzywej kalibracyjnej konieczne jest aby znac dokladne stezenie AKTYWNEGO enzymu? W przypadku enzymow oznaczenie jedynie stezenie bialka jest niewystarczajace, poniewaz czesc enzymu moze byc nieaktywna.
Zasada metody mikrobiuretowej Atomy azotu wiazan peptydowych (-NH-CO-) w srodowisku zasadowym oddzialuja z jonami Cu2+, tworzac barwny, niebiesko-fiolkowy kompleks. W czasie reakcji zachodzi redukcja jonow Cu2+ do Cu+. ?=330nm.
Jakie zwiazki moga dawac pozytywny odczyn reakcji biuretowej? Oksamid, biuret (dwumocznik), tripeptyd.
Dlaczego siarczan (VI) magnezu moze utrudniac oznaczanie bialka metoda biuretowa? W srodowisku zasadowym powstaje nierozpuszczalny wodorotlenek magnezu, maskujacy zabarwienie prob, jak rowniez sole amonowe, gdyz tworza one barwne kompleksy z jonami miedzi.
Jaki jest zakres metody mikrobiuretowej? 0,1-1mg bialka
Jak usuwa sie bialka balastowe z preparatu BPTI? Poprzez wytracanie w obecnosci 4% TCA.
W jakim miejscu przeprowadza hydrolize trypsyna? W miejscach, w ktorych grupy karbonylowe naleza do argininy albo lizyny – R lub K
Warunki oznaczania aktywnosci antytrypsynowej wobec BApNA 1. Krzywa standardowa – A410 od ilosci ?g enzymu w probie (znana ilosc akt. enzymu w probie!), 2 . Warunki: bufor 0,1M Tris-HCl o pH 8 z 20mM CaCl2, preinkubacja w 25 st. przez 5 min., start – BApNA, 10 min., stop – 30% TCA, A410 wobec slepej (bufor)
Zaleta metody mikrobiuretowej Bialko nie musi byc oczyszczone od niebialkowym zanieczyszczen, dlatego ze jest to reakcja specyficzna dla wiazania peptydowego.
Wada metody mikrobiuretowej Inne zwiazki dajace wynik +: biuret, oksamid, tripeptyd. Mg(SO4) utrudnia, bo w zasadowym srodowisku tworzy nierozpuszczalny wodorotlenek, ktory maskuje zabarwienie prob. Bialka ulegaja zniszczeniu! Krzywa tworzona ze standardu.
Zaleta metody spektrofotometrycznej Szybko i latwo, nie ma koniecznosci uzycia krzywej standardowej, bialko mozna dalej wykorzystac.
Wada metody spektrofotometrycznej Niespecyficzna, potrzeba czystego bialka (zwiazki aromatyczne i inne zanieczyszczenia absorbuja), nie nadaje sie do bialek z chromoforami, droga kuweta.
Dlaczego ekstrakcja BPTI prowadzona jest w obecnosci NaCl? Wyzsza sila jonowa zmniejsza oddzialywania elektrostatyczne (np. ze szklem), ktore moglyby byc problematyczne w ekstrakcji.
Dlaczego BPTI nie ulega denaturacji i nie wytraca sie do 4% TCA? BPTI nie ulega denaturacji ze wzgledu na wystepowanie trzech mostkow disiarczkowych, ktore powoduja, ze BPTI ma stabilna, zwarta budowe.
W jakim r-rze nalezy przechowywac trypsyne? W takim, zeby sie sama nie strawila – 20mM CaCl2,1mM HCl (pH 3)
Celowosc ekstrakcji BPTI z pluc BPTI znajduje sie w plucach, ekstrakcja 0,2M HCl – OK, bo BPTI ma pI=10,5, wiec dobrze znosi niskie pH, dodanie NaCl- obnizenie oddzialywan elektrostatycznych z plastikiem zlewki, wirowanie – pozbywanie sie fragmentow tkanek, komorek.
Celowosc wysalania roztworu z BPTI siarczanem (VI) amonu Siarczan (VI) amonu powoduje wytracenie z r-ru bialek, zageszczenie preparatu i pozbycie sie kwasow nukleinowych i lipidow.
Jak to mozliwe, ze podczas wytracania bialek balastowych za pomoca 20% TCA BPTI nie wytraca sie? Ze wzgledu na niewielkie rozmiary i wyjatkowa stabilosc BPTI pozostaje rozpuszczone w supernatancie i nie ulega wytraceniu (zachowuje swoja aktywnosc).
Do preparacji jakich enzymow mozna wykorzystac BPTI immobilizowany na Sepharose 4B? Do tych enzymow, do ktorych BPTI ma duze powinowactwo (Lys15 inhibitora jest idealnie dopasowana do kieszeni wiazacej substrat enzymu), np. bydleca ?-trypsyna, bydleca ?-chymotrypsyna, ludzkie enzymy: ?-plazmina i kalikreina osoczowa.
Jakie warunki musi spelniac bufor do oznaczania aktywnosci trypsyny? CaCl2 (np 20mM) – chroni przed samotrawieniem, pH – 8, niezbedne do zachowania aktywnosci.
Co wplywa na stabilnosc BPTI? Czy 4% TCA jest w stanie wytracic BPTI? 4% TCA nie dziala na BPTI. Wysokie pI (BPTI jest naladowane dodatnio) oraz 3 mostki disiarczkowe, ktore sprawiaja, ze BPTI jest pozawijane i ma mniejsza powierzchnie dostepna do ciecia przez proteazy.
Co powoduje dodanie kwasu solnego do probki plucek bydlecych? Pecznienie kom., rozrywanie i uwalnianie ich zawartosci na skutek szoku osmotycznego. Trypsyna nie jest aktywna. Zmniejszona szansa modyfikacji bialek. BPTI pozostaje stabilne, pozostale bialka denaturuja – uwolnienie BPTI z kompleksu z trypsyna.
Jak dziala siarczan(VI) amonu? Przy dodaniu duzej ilosci siarczanu (VI) amonu, sol eliminuje plaszcz wodny bialka, odciagajac dipole wody, i tworzy hydraty, co powoduje wytracenie bialka z roztworu. Dodatkowo stabilizuje bialko i zageszcza preparat.
Dlaczego BApNA do reakcji enzymatycznej dodajemy w duzym nadmiarze? Nie ma ryzyka, ze substrat nam sie skonczy.
Jak dziala TCA? Powoduje denaturacje i wypadanie bialek z r-ru, a takze sieciowanie wody.
Dlaczego dodaje sie NaCl podczas wstepnej ekstrakcji za pomoca HCl? Dlaczego dopiero po 1h? Zeby zwiekszyc sile jonowa, ktora zmniejsza oddzialywania elektrostatyczne np. ze szklem lub pomiedzy bialkami. Nie mozna dodac jej od razu, zeby nie wplywac na osmolarnosc roztworu.
Dlaczego BPTI jest w plucach? BPTI pelni funkcje regulujaca w stosunku do komorek tucznych (mastocytow), ktore znajduja sie m.in. wlasnie w plucach.
Dlaczego po wytracaniu bialek balastowych nalezy doprowadzic pH roztworu do wartosci 7,5? W jaki sposob sie to osiaga? pH 7,5 to pH buforu uzytego do rownowazenia kolumny . Za pomoca stezonego NaOH.
Jakie sa skladniki odczynnika Benedicta? Bezwodny weglan sodu – Na2CO3, cytrynian sodu, tiocyjanian potasu (rodanek potasu – KSCN), na koniec siarczan (VI) miedzi – CuSO4·5H2O, i heksacyjanozelazian (II) potasu – K4[Fe(CN)6]
Wzor dimeru mocznika NH2CONHCONH2
Preparatyka – CW1 Preparatyka biochemiczna – ćwiczenia

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *